ADC生产、质量控制及功能检测的审查
SDS-PAGE
我们需要运行SDS-PAGE（还原和非还原DTT）来观察抗体的完整性，并初步观察小分子的连接情况。一般来说，与裸抗体相比，偶联后的抗体分子量会上移。
DAR（方法和标准）
ADC药物本质上是一种混合物，由连接不同数量小分子药物的单克隆抗体组成。DAR表示每个单克隆抗体上连接的小分子药物的平均数量。DAR直接影响ADC药物的疗效和安全性。在药物开发阶段，应尽量缩小DAR值的变异范围。ADC药物的偶联位点分为赖氨酸残基上的氨基和半胱氨酸残基上的巯基。赖氨酸偶联的DAR值通常较小，但潜在偶联位点较多，偶联反应随机，产物异质性大；ADC药物开发中使用的链间二硫键有4对。抗体通过部分还原将链间二硫键转化为游离半胱氨酸残基，半胱氨酸残基中的巯基与连接子中的马来酰亚胺基团反应形成ADC。目前，大多数已使用或正在开发的ADC依赖链间半胱氨酸二硫键进行偶联，其中4个（IgG1和IgG4）或6个（IgG2）链间二硫键被过量还原剂（即三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇）还原。这避免了链内二硫键的破坏，同时释放了参与链间二硫键的半胱氨酸残基上的巯基（图3e）。所得产物是ADC的混合物，每个亲本IgG1或IgG4含有0-8个药物，每个IgG2含有0-12个药物，其中ADC混合物中主要为偶数DAR（0、2、4、6、8、10、12）的组分。
1. 紫外/可见光谱法（UV/VIS）
紫外/可见光谱法是检测DAR值最简单且稳定的方法。该方法要求抗体和小分子药物具有不同的最大吸收波长，并分别计算其浓度，从而得到ADC的DAR值，适用于多种ADC。
2. 色谱法
色谱法包括疏水相互作用色谱（HIC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC），适用于半胱氨酸偶联ADC的测定。疏水相互作用色谱可根据疏水性的差异分离不同DAR值的组分，并保持ADC分子的结构完整性；反相高效液相色谱需要在分析前将抗体还原为轻链和重链，可用于补充和验证疏水相互作用色谱的结果，并适用于质谱分析。
3. 质谱法
质谱法适用于赖氨酸偶联ADC的DAR值测定，包括液相色谱-串联质谱法和MALDI-TOF-MS。赖氨酸偶联ADC异质性较强，增加了质谱分析的难度。通常需要在测定前对ADC进行额外的预处理，例如去糖基化和去除C端赖氨酸异质性。
ADC的细胞毒性实验
在抗体的DAR确定后，需要进行ADC的细胞毒性实验。用不同剂量的ADC处理细胞，分析其EC50。在体外细胞毒性实验中，对照组细胞敲除了靶基因，因此抗体失去了定位作用，无法杀伤肿瘤细胞，不表现出剂量规律性。然而，从未敲除细胞的处理结果来看，它们通常具有较好的杀伤作用和EC50。
查看抗体药物偶联物（ADC）知识库