Sandhoff 病（SD）は HEXA/HEXB 遺伝子の欠損によって引き起こされ、Hex 酵素の欠失と GM2 ガングリオシドのリソソーム内蓄積を招く。従来の研究では脳内または脳脊髄液経路による AAV 送達が多く用いられてきたが、侵襲性が高い。本研究では静脈内注射のバイシストロニック AAV9 ベクターに変更し、症状発現前（約 1 月齢）の SD ネコモデルを治療した。核心的な矛盾は、静脈内送達が血液脳関門を越える必要があること、そして二つのサブユニットの共発現効率を保証することが難しい点にある。
バイシストロニック設計：単一ベクターの必要性
研究では単一の AAV9 ベクターを採用し、中央に CMV エンハンサー、両側に逆方向に配置したニワトリ β-actin プロモーターを備え、それぞれが Hex α および β サブユニット cDNA を駆動する。この設計の製造プロセス上の論理は明確である。もし二つの独立したベクターを用いた場合、静脈内注射後の血流による希釈により、同一細胞が二つのベクターで共形質導入される確率は極めて低くなる。一方、GM2 を分解する唯一の活性型は HexA（αβ）であり、二つのサブユニットは同一細胞で発現される必要がある。
低用量（5×10¹³ vg/kg）では生存期間が 4.3 か月から 8.3 か月に延長し、高用量（2×10¹⁴ vg/kg）では 12.4 か月に達した。高用量群では全身性振戦が出現しなかったが、低用量群では 4 匹中 3 匹で 6.8 か月まで遅延して出現した。
組織分布と発現効率の製造プロセス上の矛盾
ベクター分布データによると、大脳皮質の濃度が最も高く（0.050–9.658 vg/二倍体ゲノム）、小脳、脳幹、脊髄はより低かった。しかし肝臓のベクターコピー数が最も高いにもかかわらず、HexA 活性は常に正常の 0.09 倍を超えなかった。「比活性/ベクターゲノム」比を計算すると、脳、脊髄、骨格筋、心臓の比は肝臓の 23.0–139.8 倍であった。
この差異は製造プロセス層面の重要な問題を指し示している。ベクターゲノムの豊富さは機能性タンパク質の産出量と等しくない。著者らは、このベクターが WPRE エレメントを欠いており、WPRE は肝臓において発現を最大 5.8 倍向上させ得ると指摘している。さらに、ネコの肝臓はそれ自体が特定の AAV 設計の発現に不利である可能性がある。製造プロセス開発にとって、組織特異的プロモーターや発現増強エレメントの取捨選択は、単位ベクターあたりの治療効果産出に直接影響する。
短期的な是正と長期的な減衰
16 週時点で、高用量群の GFAP 染色、Iba1 形態、Olig2 陽性細胞数はいずれも正常に近づいた。しかし長期追跡（人道的終点まで）では、星状膠細胞とミクログリアの形態が再び未治療群に近づき、炎症は一時的にしか逆転しなかった。
同時に、ベクターコピー数は短期群から長期群にかけてほぼすべての CNS 領域で減少し、形質導入細胞の分裂による消失または免疫反応と関連している可能性がある。すべての治療ネコで AAV9 抗体価（1:1000–1:256,000）が産生され、これは再投与が無効あるいは危険である可能性を意味する。
AAV 調製と精製プロセスへの示唆
この研究の用量依存効果は明確であるが、高用量群でもなおすべての指標が完全に正常化したわけではない。製造プロセスの観点からは、いくつかの問題が注目に値する。第一に、肝臓での高い取り込みと低い発現は、非標的組織へのベクター分布が有効用量を圧迫している可能性を示唆する。第二に、長期的な発現減衰とベクターゲノムの消失は、ベクター純度、空殻率、形質導入効率のバランスに関わる。第三に、抗体産生が反復投与を制限し、単回投与のベクター品質を可能な限り高くすることを要求する。
精製プロセスにおいて、空殻比率をいかに低減し、完全なゲノムパッケージング効率をいかに高めるかは、単位 vg あたりの機能産出に直接関係する。また、組織分布と発現効率の解離現象は、製造プロセス評価がベクターコピー数だけを見るのではなく、機能性タンパク質活性と組み合わせる必要があることを示唆している。
一つの未解決問題：静脈内送達されたベクターが肝臓に大量に蓄積しながらも発現しない場合、製造プロセス側は組織標的性の最適化を優先すべきか、それとも単一細胞の形質導入効率の向上を優先すべきか？
